应用化学专业“综合与设计实验”是在基础化学实验(无机化学实验、有机化学实验、分析化学实验、物理化学实验)基础上开设的，是实验课程体系中的提高阶段，是为了进一步提高学生的实践与创新能力，为其今后从事科研及相关食品、检测等工作打下良好基础[1]。将科研内容引入教学实验，是实现教学与科研相互衔接的重要途径。为此，一些大学基于现有的科学研究工作和科研项目成果，对大学综合设计实验的教学进行了探索和创新[2-4],提高了学生的创新能力和科研热情。
内蒙古农业大学理学院化学化工系选定“食品中蛋白质含量的测定(凯氏定氮法)”作为应用化学专业综合实验教学内容之一。蛋白质的测定是评价粮食品质的重要指标之一。目前，测定蛋白质含量的方法主要有双缩脲法、甲醛滴定法、杜马斯燃烧法、考马斯亮蓝法、凯氏定氮法等[5]。其中，凯氏定氮法灵敏度高、稳定性好，是测定蛋白质含量的国家标准方法[6]。凯氏定氮法已实际用于乳制品中蛋白质含量的测定[7],奶粉中蛋白质的测定[8],粮食中的蛋白质含量的测定[9],化肥中总氮含量的测定[10]及医药品中氮含量的测定[11]等方面。
全自动凯氏定氮仪是一种新的自动分析测试设备，它采用高精度颜色传感器判断终点，智能化程序控制，可自动完成加水稀释、加酸、加碱、蒸馏、滴定、滴定杯自动排液清洗、结果计算和输出打印结果，全程无需人为干预，数据准确可靠，被广泛应用于肥料、食品等样品含氮量或蛋白质含量的分析测定。2017年理学院购进1台K9860全自动凯氏定氮仪并在该综合实验教学中得到应用，至今已在两届学生中成功完成实验教学，学生能够积极参与到实验中，实验教学效果和反响非常好。
1 仪器与药品试剂
1.1 仪器与药品
K9860全自动凯氏定氮仪(中国济南海能仪器股份有限公司);SH420/420F 石墨消解仪(中国济南海能仪器股份有限公司);电子天平(德国赛多利斯，Quintix224);硼酸(AR,500g);甲基红(AR,500g);溴甲酚绿(AR,10g);氢氧化钠(AR,500g);盐酸(AR,500mL);硫酸(AR,500mL);硫酸铜(AR,500g);硫酸钾(AR,500g);武川莜面等。
1.2 测试用试剂及其配制(学生自配)
(1)硼酸溶液(约20g/L):用百分之一天平称取20.0g的硼酸，溶解于1000mL的去离子水中，搅匀。一般配制3000mL,装于硼酸溶液桶中。
(2)混合指示剂：0.1g甲基红用乙醇完全溶解并定容至100mL容量瓶(甲基红呈晶体状，配制时较难溶解，先用50～60mL乙醇超声溶解，再定容至100mL);0.1g溴甲酚绿用乙醇完全溶解并定容至100mL容量瓶。再取1份的甲基红乙醇液与5份溴甲酚绿的乙醇液，两者混合。
(3)一般配制3L的硼酸溶液(20g/L),则需加入上述配制好的5.00mL甲基红的乙醇液和25.00mL溴甲酚绿的乙醇液。最终含混合指示剂的硼酸溶液的应该为pH=4.6～4.8,用酸度计测试(若pH不在此范围内pH=4.6～4.8,用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH调节)。
(4)氢氧化钠溶液(约400g/L,近似浓度即可),称取400g氢氧化钠，用1000mL去离子水搅拌溶解，冷却至室温。一般配制5L备用。
(5)盐酸标准滴定溶液(CHCl=0.1mol/L)的配制与标定：移取9mL浓盐酸(分析纯),去离子水稀释并定容至1000mL容量瓶中，摇匀，浓度近似0.1mol/L;用基准物质硼砂(Na2B4O7·10H2O,M=381.37g/mol)标定HCl浓度：准确称取0.4～0.5g硼砂于250mL锥形瓶内，加入30mL蒸馏水，加热溶解，冷却后加入1～2滴甲基红指示剂，用该0.1 mol/L HCl溶液滴定至溶液由黄色变为橙色，即为滴定终点。根据称取硼砂的质量和滴定时所消耗HCl溶液的体积，计算出HCl标准溶液的准确浓度。
2 SH420/420F消化操作步骤
2.1 空白和样品消化前准备
称取0.2g CuSO4,3g K2SO4,10mL浓硫酸依次加入到干燥的消化管中，随后准确称取1g左右的莜面，并记录质量m1,加入到消化管中(由于在添加的过程中莜面容易粘到消化管壁上，所以称量时将莜面包在滤纸内(叠为滤纸小包)直接将滤纸和莜面一起送到消化管底部，每组实验准备2份空白(不添加莜面，标记为1号、2号消化管)和待测样3份(添加莜面，标记为3号、4号、5号消化管)。将消化管置于消化炉内(尽量放在中间),每个消化管上方架一个小漏斗，用于回流蒸发上来的酸液。最后将5个消化管放置在石墨消解仪上消解。
2.2 消化加热方式的选择和设置
消化过程选择曲线加热，按面板【确认】键后进入曲线加热设置界面。按照“温度-时间”设置3段加热程序。两组学生采用两种方案进行消化。(1)01 220oC,00:20;02 340oC,00:20;03 420oC,00:60;(2)01 220oC,00:20;02 340oC,00:20;03 420oC,00:30;设置完毕-确认，整个过程保持通风橱开启状态。消化结束，架起来消化管自然冷却并关机。
2.3 两种消化方案消化效果对比
石墨消解是样品进行化学分析之前不可缺少的处理方法之一。石墨消解仪温度可程序调控，消化管整体受热均匀，消解快速彻底，操作简单，仪器安全性能高。
图1(a)为采用消化方案(1)中的2个空白和3个样品消化前状态。采用该方案消化结束即刻，2个空白和3个样品的溶液为透明的绿色(图1(b)),自然冷却后转而变为蓝绿色液体(图1(c))。采用方案(2)消化结束并自然冷却后，2个空白溶液均为蓝绿色，这与方案(1)消化后颜色几乎一致，但3个样品消化后为深绿色液体甚至棕褐色。两种方案起初低温加热(220oC),是为防止试样起泡沫或碳化后颗粒粘附于消化管，导致消化不完全，所测结果偏低。中间段(340oC)过渡加热，缓慢程序升温至高温420oC。两种方案仅在最后高温420oC加热停留时间有差别，方案(2)30分钟的高温消化时间较短，消化不完全，导致消化结束后溶液颜色显现异常(图1(d))。
图1方案1中(a)2个空白和3个样品消化前;(b)2个空白和3个样品消化结束后即刻;(c) 2个空白和3个样品消化结束并自然冷却后；方案2中(d)2个空白和3个样品消化结束并自然冷却后
3 凯氏定氮仪测定原理、仪器调试及样品测试
3.1 测定原理
全自动凯氏定氮仪测定含氮样品中总氮含量的原理是样品与催化剂和浓硫酸一起加热消化分解，样品中的有机氮转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并被过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸溶液滴定，根据消耗的盐酸标准溶液的体积计算出样品中的含氮量，再乘以蛋白质转化系数，得蛋白质含量。
3.2 全自动凯氏定氮仪的调试
3.2.1 开机前准备
检查试剂是否充足，试剂应满足本批实验使用量。打开冷却循环水，开机，仪器显示正在初始化。
3.2.2 测样前准备
进入清洗界面，选择硼酸管路清洗，需清洗3次左右；选择换酸清洗，需清洗3次。
3.2.3 蒸空管预热
放置一个空管，做空白测试，连续做4个空白测试。参数设置为：空白体积 0mL,硼酸20mL,稀释水10mL,碱 0mL,蒸馏 5min。一般第1次空白测试结果舍掉不取，后3次结果，最大滴定体积减去最小滴定体积小于0.05mL,仪器即为稳定。Δ=0.0793mL-0.0661mL=0.0132mL﹤0.05mL,表明全自动凯氏定氮仪已达稳定状态，可以进行下一步的空白样品测试和样品测试。
表1空管空白测试结果
|
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
滴定体积/mL |
0.3263 |
0.0793 |
0.0752 |
0.0661 |
|
结果取舍说明 |
舍去不取 |
最大 |
居中 |
最小 |
3.3 空白样品测试和样品测试
3.3.1 空白样品测试
将消解好的两种消化方案下的各自2个空白样品依次上机测试。参数设置：空白体积0mL,硼酸20mL,稀释水15mL,碱的体积是消解时浓硫酸的4倍为宜(40mL),蒸馏5min。测试完成后将测得的滴定体积平均值输入到仪器“空白体积”这项，下一步准备测试样品。测试结果及测试数据见表1、表2。
表2两种消解方案的空白样品测试数据
|
空白样品 |
方案一1号 |
方案一2号 |
方案二1号 |
方案二2号 |
|
滴定体积/mL |
0.1616 |
0.1392 |
0.1230 |
0.1392 |
|
空白体积 |
0.1504 |
0.1311 |
3.3.2 样品测试
将消解好的两种消化方案下的各自3个莜面样品上机测试，输入样品重量进行自动测试。参数设置：空白体积：输入样品空白测试时的滴定体积(方案一为0.1504mL,方案二为0.1311mL),硼酸20mL,稀释水15mL,碱的体积是消解时浓硫酸的4倍为宜(40mL),蒸馏5min。K9860全自动凯氏定氮仪正常运行状态见图2所示。测试完成后自动排废，并自动计算结果和显示，数据结果如表3所示。可以看出，采用方案一消化后的莜面样品含蛋白量测试均值(8.2120%)高于方案二消化后的莜面样品含蛋白量测试均值(7.9028%),这是由于采用方案二消化不完全不彻底，所以含氮量及含蛋白量测试值相比于方案一结果偏低。使用全自动凯氏定氮仪测得的含氮量及含蛋白量结果与前期样品的消化处理充分与否有很大关系。
表3两种消解方案下莜面样品含氮量和含蛋白量测试结果
|
消化管编号 |
方案一3号 |
方案一4号 |
方案一5号 |
方案二3号 |
方案二4号 |
方案二5号 |
|
标准酸浓度/mol·L-1 |
0.0891 |
0.0891 |
0.0891 |
0.0891 |
0.0891 |
0.0891 |
|
样品重量/g |
1.0030 |
1.0028 |
1.0016 |
0.9930 |
1.0011 |
0.9999 |
|
滴定体积/mL |
11.5287 |
11.4769 |
11.3814 |
10.7268 |
11.0968 |
11.0836 |
|
空白体积/mL |
0.1504 |
0.1504 |
0.1504 |
0.1311 |
0.1311 |
0.1311 |
|
蛋白系数 |
5.8300 |
5.8300 |
5.8300 |
5.8300 |
5.8300 |
5.8300 |
|
含氮量/% |
1.4161 |
1.4099 |
1.3997 |
1.3320 |
1.3673 |
1.3673 |
|
含蛋白量/% |
8.2559 |
8.2199 |
8.1603 |
7.7654 |
7.9715 |
7.9715 |
|
含蛋白量均值/% |
8.2120 |
7.9028 |
3.4 关机前清洗
3.4.1 蒸空管清洗
测试界面下：消化管内加入少量的蒸馏水，上机蒸馏，一般清洗2次左右。参数设置：空白体积：0mL,硼：20mL,稀释水：0mL,碱：0mL,蒸馏5min。
3.4.2 管路清洗和接收杯清洗
清洗界面下：选择碱管路清洗，清洗2次，接收杯清洗1～2次。
3.4.3 蒸馏头清洗
用洗瓶冲洗蒸馏头上的碱液残留，冲洗废液接收盒，擦拭干净仪器后关机并关闭冷却循环水。
图2 K9860全自动凯氏定氮仪正常运行状态
4 结语
凯氏定氮法作为国标中检测食品中蛋白质的经典方法，被广泛应用于食品、肥料、农作物、种子和土壤等样品的含氮量或蛋白质含量的分析测定。开展本综合实验，内系统地掌握了石墨消解仪的操作和全自动凯氏定氮仪测定原理、仪器调试、样品测试和清洗维护，强化了实际动手操作技能，学生为以后从事相关工作奠定了实践基础，有助于培养实践型人才。实验中贯穿设计的两种消化方案、消化效果和莜面含蛋白质量的测定结果初步对比分析，有助于激发其科研兴趣，为科研创新型人才的培养做出了新的尝试。
发布时间：2025-12-11 
上一篇：
返回列表